乳腺癌循环肿瘤DNA潜在价值探索
作者：王文娜马飞徐兵河
单位：国家癌症中心、中医院
徐兵河教授，中国医学科学院、北医院内科主任，国家食品和药品监督管理局新药审评专家，中国临床肿瘤学会专业委员会常委和乳腺癌专业委员会常委、北京市中西医结合学会肿瘤专业委员会副主任委员、中国医学科学院学术委员会委员、国家科技进步奖与技术发明奖评审委员。
乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一，GLOBOCAN资料显示年全球共约有万乳腺癌新增病例，总死亡约52.2万例，居女性癌症死因的第二位，因此其早期诊断、疗效预测及改善预后仍是临床科研工作者的研究重点。乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，随着蛋白质组学、分子病理学及基因组学的发展进步，乳腺癌的诊疗已进入分子分型指导下的个体化诊疗时代。循环肿瘤标志物在乳腺癌中的应用受到越来越多的 肿瘤细胞来源的cfDNA常携带肿瘤相关的遗传特征，如点突变、基因扩增、基因重排、过度甲基化等，这一特点有助于鉴别肿瘤来源的DNA及正常细胞来源的NDA。以聚合酶链式反应（PCR）或二代测序（NGS）为基础的高敏感性、高通量检测技术的进步促使在血液中大量的cfDNA中辨别出少量的携带肿瘤相关单核苷酸变异（SNV），拷贝数改变（CNA）及结构变异等遗传学改变（SV），实现ctDNA的定量和定性检测。以PCR为基础的常用检测方法敏感度较高，可达0.%～0.1%，常用的检测方法有数字PCR（dPCR）、微滴式数字PCR（ddPCR）、实时定量荧光PCR（RT-PCR）、珠乳扩磁（BEAMing）。NGS为基础的高通量检测方法可以提供更多基因组学信息，尤其是对未知遗传变异的探索，常用的检测方法有全基因组测序、全外显子测序、TAm-Seq、Safe-SeqS等。
ctDNA在乳腺癌中的应用价值探索
乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，基于组织活检技术的现有遗传或表观遗传学分析技术存在一定的局限性，难以克服肿瘤内部或不同病灶异质性及肿瘤遗传变异可能随时间发生改变的局限。与组织活检相比，ctDNA提供了更全面精确的肿瘤遗传组学信息。另外，以血浆或血清作为体液活检的标本，检测外周血ctDNA因其简便易行、侵害性小、实时动态佳等优势，在乳腺癌领域得到了广泛研究。
大量临床研究基于ctDNA检测而发现乳腺癌患者携带的肿瘤相关单核苷酸变异、拷贝数改变及结构变异等遗传学改变，为乳腺癌诊断、监测肿瘤负荷及治疗疗效、探索耐药机制、预测疾病复发、判断预后等方面提供依据。
1.ctDNA对乳腺癌的诊断价值
乳腺癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，且其发病率持续上升。为了降低乳腺癌的病死率和改善预后，寻找一种早期诊断的方法十分迫切。在健康人血中的cfDNA主要来源于有核细胞的凋亡，由于巨噬细胞自身的清除作用，健康人血中的cfDNA含量维持在较低水平。癌症患者癌细胞的坏死、凋亡及主动分泌所释放的DNA使患者的cfDNA维持在较高水平。自年，研究发现乳腺癌患者血液中的cfDNA含量较健康人高，此后多项研究发现cfDNA含量在健康人群、良性乳腺疾病及不同分期的乳腺癌患者中有差异。Huang等发现血浆cfDNA在乳腺癌患者中的平均浓度为65ng/ml，明显高于乳腺良性疾病患者的22ng/ml和健康人的13ng/ml，对于乳腺癌的诊断、筛查有一定意义。Catarino等进行的一项研究显示，乳腺癌患者的cfDNA浓度平均为.2ng/ml，健康人为77.06ng/ml，患者术后cfDNA水平明显下降，平均为59.0ng/ml，而淋巴结转移和（或）远处转移的患者cfDNA浓度更高。这也提示了cfDNA浓度可能与肿瘤负荷相关。
由于早期乳腺癌患者血液中的ctDNA含量较低，因此检测ctDNA受到一定限制，但随着高敏感度检测技术的进步，检测ctDNA在提示早期乳腺癌显示出了协助诊断价值。PIK3CA突变是乳腺癌患者最常见的基因突变之一。Beaver等用ddPCR方法对29例术前早期乳腺癌患者的组织标本和血浆进行PIK3CA突变检测，研究结果显示ctDNA检测PIK3CA突变的敏感度达93%，特异度达%。另一项研究比较了ctDNA表观遗传学改变与传统的肿瘤标志物CEA和CA15-3在乳腺癌中的诊断价值。Yamamoto等对乳腺癌患者血清中异常甲基化的GSTP1、RASSF1A、RARβ2基因水平进行检测，研究结果显示，对于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，甲基化的ctDNA较CEA或CA15-3的敏感度更高（Ⅰ期乳腺癌：24%比8%，Ⅱ期乳腺癌：26%比8%），在Ⅲ期和Ⅳ期转移性乳腺癌中的敏感度接近，两者结合可将转移性乳腺癌的诊断敏感度提高到78%。
2.ctDNA对乳腺癌治疗疗效监测价值
ctDNA作为一种“液体活检”工具具有良好的敏感度及特异度。通过检测ctDNA所携带的肿瘤特异性突变、拷贝数改变及结构变异等遗传学改变可用于监测肿瘤负荷变化，进而协助评估治疗疗效，指导临床诊疗策略的制定。
剑桥大学癌症研究所Dawson等进行的一项发表于NEJM的研究为ctDNA在监测肿瘤负荷、评价治疗疗效的临床价值提供有力证据。研究纳入了接受化疗的52例进展期乳腺癌患者，其中30例患者的肿瘤组织检测到遗传学改变。应用TAm-Seq方法，其中25例（48.1%）患者肿瘤组织中检测出含TP53突变或PIKC3A突变，应用全基因组测序方法9例患者的肿瘤组织进行检测，其中8例患者检测到基因结构变异，其中有5例患者的肿瘤组织同时检测到基因突变和结构变异。对30例肿瘤组织检测到体细胞性突变或结构变异的患者的血浆应用dPCR或TAm-Seq方法进行基因组学检测，其中29例（97%）患者血浆中检测到ctDNA研究者发现治疗过程中ctDNA拷贝数变化曲线体现出与治疗疗效及肿瘤负荷变化一致性，提示ctDNA可用于监测肿瘤负荷变化。此外，分析发现ctDNA对监测肿瘤负荷变化的敏感度和一致性均高于CTC、CA-及影像学评价。抑癌基因甲基化片段较特异地存在于癌症患者血液中，很少存在于健康人，研究显示监测乳腺癌患者血浆甲基化ctDNA水平变化可应用于治疗疗效评价，甲基化的ctDNA作为体液标记物具有较好的研究前景。
恶性肿瘤中常见RAS相关结构域家族1A（RASSF1A）基因甲基化，有研究发现具有乳腺癌高危风险的女性体内RASSF1A异常甲基化非常多见，并在确诊的数年前即可发现。Avraham等进行的一项研究对52例进行AC-TH方案新辅助化疗的局部晚期乳腺癌患者进行了分析，80%以上的患者肿瘤组织中检测到RASSF1甲基化，应用甲基化敏感性PCR检测方法（MSHRM），在21例新辅助治疗前患者的基线血清中检测到甲基化RASSF1。随着的治疗进程，动态检测此21例患者的血清甲基化RASSF1水平变化，研究者发现治疗过程中甲基化RASSF1水平变化与治疗疗效及肿瘤负荷变化具有一致性。此外，分析结果提示4例病理完全缓解（pCR）患者血清中甲基化RASSF1A水平在治疗早期明显下降直至消失，而部分缓解或稳定的患者RASSF1A甲基化水平高于pCR患者，且持续存在。在另一项研究中，Takahashi等对87例Ⅱ期或Ⅲ期乳腺癌新辅助化疗前、后血浆标本进行甲基化RASSF1基因检测。研究结果提示在20例（23.0%）新辅助治疗前患者的血浆中检测到甲基化RASSF1，其敏感度优于CEA（8.6%）或CA15-3（7.4%）。治疗有效患者的甲基化RASSF1水平显著下降（P=0.），且新辅助化疗后甲基化RASSF1水平与残余肿瘤负荷相关（P=0.）。以上研究提示ctDNA可作为乳腺癌的新型肿瘤标志物，其在监测肿瘤负荷变化及评价治疗疗效方面的具有较好的临床应用价值。但目前研究样本量小，尚需大样本研究加以验证。
3.ctDNA应用于乳腺癌耐药发生机制的探索
原发耐药或获得性耐药是进展期乳腺癌患者治疗面临的严峻挑战和亟待解决的难题。对乳腺癌患者ctDNA的监测为探索耐药发生机制提供了新的研究方向。
在治疗过程中，不同的时间点对患者ctDNA进行全外显子测序分析有助于发现与获得性耐药相关的基因突变，进一步指导临床治疗。年发表于Nature杂志的一项研究揭示了突变的ctDNA应用于探索继发性耐药机制的价值，Murtaza等对2例的转移性乳腺癌患者的血浆ctDNA进行全外显子测序，研究发现基因突变频率的升高与治疗耐药相关。其中一例患者的分析结果表明PIK3CA（EK）突变频率升高与紫杉醇耐药相关，治疗前PIK3CA（EK）突变频率为14%，紫杉醇治疗耐药后PIK3CA（EK）突变频率升至34%。另一例患者的分析结果显示MED1（SX）突变频率升高与他莫昔芬联合曲妥珠单抗耐药相关，治疗前MED1（SX）突变频率为4%，治疗耐药后MED1（SX）突变频率升至15%。既往研究提示在乳腺肿瘤细胞中检测到MED1突变与他莫昔芬耐药相关。拉帕替尼联合卡培他滨二线治疗耐药与GAS6基因突变频率的升高相关，治疗前GAS6基因突变频率为6%，经治疗耐药后基因突变频率升至30%。Murtaza等进行的另一项研究对一例ER阳性、HER2阳性的转移性乳腺癌患者进行全外显子测序，分析结果显示拉帕替尼耐药后患者血浆ERBB4（HG）突变频率明显升高，PIK3CA（EK）突变频率的升高与他莫昔芬联合曲妥珠单抗耐药相关。
约66.7%的乳腺癌患者ERα阳性，这些患者通常对内分泌治疗敏感，ERα的表达受ESR1基因调控。但是在临床治疗中，约50%激素受体阳性乳腺癌患者会出现内分泌耐药。约20%行内分泌治疗的乳腺癌患者可检测到ESR1基因的突变，进而导致患者对芳香化酶抑制剂（AI）的耐药的发生。
多项研究提示检测ER阳性的晚期乳腺中患者血液ctDNA，可以发现ESR1突变。Schiavon等对例ER阳性和43例ER阴性的晚期乳腺癌患者血浆进行突变ESR1检测，研究结果显示ER阴性患者血浆中未检测到ESR1突变，ER阳性患者中18例（14%）患者血浆检测到ESR1突变（P=0.），此18例患者均有AI治疗史，且ESR1突变患者接受AI治疗后无进展生存期（PFS）明显短于血浆未检测到ESR1突变患者（风险比[HR]为3.1；95%CI为1.9～23.1；P=0.），提示突变ESR1与芳香化酶抑制剂治疗耐药相关。另外在BOLERO-2试验中，Chandarlapaty等对患者进行ctDNA检测，结果提示依维莫司给ESR1基因DG突变患者带来3.1个月的PFS生存获益，而ESR1基因YS突变患者的未从依维莫司中明显获益。因此，在疾病进展发生之前，可以通过检测患者ctDNA中是否存在ESR1突变，进而更早的指导治疗策略的制定。
4.ctDNA应用于评估乳腺癌术后微小残留及早期预测疾病复发
由于早期乳腺癌或手术后患者的肿瘤负荷较小，早期患者血液中的ctDNA含量通常较低，因此在早期患者中进行检测ctDNA受到一定限制，但随着基于PCR高敏感性检测技术和基于NGS高通量检测技术的进步，检测ctDNA在提示早期乳腺癌患者根治性术后仍存在微小残留病灶及早期预测疾病复发中显示出了临床应用价值。
PIK3CA是乳腺癌常见突变基因，Beaver等进行的一项研究应用ddPCR技术对29例早期乳腺癌患者的手术前血浆ctDNA及乳腺癌原发病灶组织进行了PIK3CA突变检测。分析结果显示，15例患者的肿瘤组织中检测到PIK3CA突变，其中14例患者的手术前血浆检测到PIK3CA突变基因，提示ddPCR方法检测血浆PIK3CA突变敏感度为93.3%，特异度为%。进一步证明了检测早期乳腺癌术后血液ctDNA的可行性。在10例术前检测到血浆PIK3CA突变（频率：0.01%～2.99%）的患者中，5例患者术后血浆中仍检测到了PIK3CA突变（频率：0.01%～0.06%）。Garcia-Murillas等应用NGS技术等对42例早期乳腺癌患者进行了原发病灶进行了突变基因检测。应用ddPCR技术对这些患者的血浆组织进行相对应的突变基因检测。
ctDNA检测的时间点包括基线（治疗前）、手术后、随访过程中每6个月检测一次。13例患者的基线血浆中检测到了ctDNA，与未检测到ctDNA的患者相比，基线血浆中检测到ctDNA的患者具有较短无病生存期（DFS），但差异无统计学意义（P=0.）。7例患者术后血浆中检测到ctDNA，与未检测到ctDNA的患者相比，术后血浆中检测到ctDNA的患者具有较短DFS（P﹤0.0，HR为25.1；95%CI为4.08～.5）。研究结果显示患者术后血液ctDNA可提早预测疾病复发，ctDNA预测复发早于临床发现复发的中位时间为7.9个月。Olsson等对20例乳腺癌术后血液标本进行ctDNA检测，研究显示ctDNA预测疾病复发的敏感度为93%，特异度为%。临床检查发现与疾病复发相比，在86%的患者中，ctDNA提早平均11个月预测了疾病的复发。研究进一步显示，与术后血液中未检测ctDNA的患者相比，仍能检测到ctDNA的患者DFS明显缩短，且ctDNA的含量与患者生存相关。另一项研究对例对他莫昔芬术后辅助治疗的血清标本进行了甲基化RASSF1A水平监测，结果显示19.6%患者他莫昔芬治疗前血清标本检测到甲基化RASSF1A。乳腺癌患者血浆甲基化RASSF1A水平显著下降或消失提示他莫昔芬治疗有效，持续保持高水平或突然升高均提示他莫昔芬辅助治疗耐药。22.3%患者他莫昔芬治疗1年后血清标本仍检测到甲基化，且这些乳腺癌患者更易出现疾病复发（相对风险[RR]为5.1；95%CI为1.3～19.8）。
以上研究显示ctDNA预测早期乳腺癌患者术后复发转移的潜在价值，提示影像学检查难以发现微小转移灶的存在。早期乳腺癌患者术后血液中仍检测到ctDNA提示患者可能存在高危复发风险，但仍需要更多的研究证明术后患者血液中检测到ctDNA是否可以指导临床术后辅助治疗策略的制定。
5.ctDNA预测乳腺癌患者预后
循环肿瘤DNA对于乳腺癌预后评价的价值也研究中得到证实。Dawson等进行的研究对30例Ⅳ期乳腺患者进行分析，发现患者血浆ctDNA拷贝数水平与乳腺癌患者的预后相关，ctDNA拷贝数低的患者生存期更长。ctDNA甲基化检测对乳腺癌患者预后也具一定预测价值。Nakauchi等研究发现晚期乳腺癌患者血浆中TP53突变或PIK3CA突变阳性患者生存率显著低于ctDNA阴性者（P﹤0.05），而患者血浆中CEA或CA15-3水平与预后无显著相关性（P=0.；P=0.）。研究显示患者治疗前血清中某些基因如RASSF1A、APC等的甲基化水平是乳腺癌患者预后影响因素，与更短的生存期相关。Fujita等在例早期乳腺癌的血清循环DNA中同时检测GSTP1、RASSF1A和RARβ2甲基化水平，分析结果显示分别在7%、2%和2%的患者血清中检测到甲基化的GSTP1、RASSF1A和RARβ2。met-DNA对于乳腺癌患者具有独立的预后预测价值，met-DNA阳性患者DFS和OS较短（P=0.，P=0.）。Fiegl等进行的研究多因素分析结果提示乳腺癌根治术后患者他莫昔芬治疗后血清中甲基化RASSF1A持续存在作为独立预后指标提示患者具有较高的复发率（RR为5.1；95%CI为1.3～19.8）和病死率（RR为6.9；95%CI为1.9～25.9）。
但另一项研究在晚期三阴性乳腺癌中进行的一项研究并未得出相同结论。该研究评价并比较了血浆CTC与ctDNA预测晚期三阴性乳腺癌预后的价值。研究纳入了40例患者，31例患者的肿瘤组织和血浆中均检测到突变型TP53，其中19例（70%）患者血浆CTC≥1；14例（52%）患者血浆CTC≥5。与CTC＜5的患者相比，CTC≥5的患者具有较短的疾病进展时间（P=0.06）和总生存（P=0.）。遗憾的是研究结果显示ctDNA水平的差异与患者预后无相关性。以上研究提示ctDNA预测晚期乳腺癌患者预后的价值和临床应用价值需要在不同分子亚型的乳腺癌患者进一步探索和验证。
结语
综上所述，ctDNA作为一种“液体活检”方法因其简便易行、侵害性小、实时动态佳等优势受到肿瘤学家的广泛
