非小细胞肺癌中的循环生物标志物的现状和未
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，部分归因于多数病人确诊时就已处于中晚期。因此，肺癌的早期诊断和筛查非常重要。当今的研究方向主要聚焦在细化肺癌的筛查和个性化治疗，这包括针对高危人群的大规模早期筛查诊断和高灵敏度生物标记物的发现。
根据不同分子谱，可将非小细胞肺癌（Nonesmall-celllungcancer，NSCLC）分为若干个分子亚型，并辅以特异生物标志物检测指导治疗方案。在NSCLC的个体化治疗中，主要发展了针对EGFR、ALK、BRAF、MET、ROS1、RET和HER2等的小分子抑制剂，前期虽然能产生较高的应答率并延长了无进展生存期，但后期的耐药性却无法避免。因此，肺癌治疗中有两个高度未满足的需求：一个是肺癌的早期诊断，以便进行快速治疗干预，提高治愈的可能性；另一个是对于“一刀切”治疗到个性化治疗方法的优化，以适应肿瘤分子谱的不断变化。
在癌症早期诊断和监控中液体活检非常重要，它可以非介入性，重复获得体液样本，克服原发组织和其他组织间的异质性，指导医生们建立基因表达谱，靶向突变用药，快速判断治疗是否有效，及随肿瘤的发展而调节治疗方案，甚至可以为更多的病人实现个体化治疗。在包括非小细胞肺癌在内的众多癌症中，液体活检的主要标记物有：循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）、cfDNA（CirculatingCell-FreeDNA，cfDNA）以及microRNA（miR）。
?CTCs
循环肿瘤细胞（CTCs）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，肿瘤细胞进入人体外周血并发展成转移灶是癌症的一个重要标志。CTCs在健康人群中并不存在，而在化疗敏感或化疗不耐受的肺癌中均能检测到具有恶性标志的CTCs。CTCs作为临床检测工具，其分离、表征和计数的方法也在发展中。常用的检测分离CTCs技术有三种：1.富集法，通过上皮细胞标记物在血液中快速高效的富集CTCs，其代表为美国Veridex公司的CellSearch系统，该系统采用包被抗EpCAM及抗CD45抗体的纳米颗粒进行正、负筛选。2.过滤法，以细胞大小差异和过滤为基础，其代表为法国RareCellDiagnosis公司的ISET系统。3.CTC-chip技术，这是一种基于微流体学的新兴CTC检测技术。
在临床上，CTC的数目与NSCLC的诊断、治疗应答的预测和预后都具有相关性。在NSCLC的诊断上，有研究表明CTC的数目能有效说明原发性肺癌中肿瘤是否转移、并实现慢性阻塞性肺疾病恶化成肺癌的早期诊断、划分NSCLC的发展阶段。在治疗应答的预测中，研究发现，如果CTC数目与PFS、OS期和ORR存在相关性。此外，CTCs还能做进一步的分子鉴定，比如对肿瘤细胞中mRNA特异性的转录分析，以及检测CTCs中EGFR、ALK、ROS1等分子标记物等。这些都说明在非小细胞肺癌中CTCs能作为临床疗效的一种实时监测指标。在肺癌的预后上，晚期或切除性根治NSCLC中，CTC数目与病人的PFS和OS期存在显著相关性，说明CTCs是NSCLC潜在预后标志物。
?cfDNA
cfDNA是指原发肿瘤甚至是转移形成的新肿瘤上的坏死或凋亡的细胞上破裂掉落下来的DNA片段，以及正常细胞产生的DNA片段，两者一起进入外周血循环系统。肿瘤中坏死和凋亡细胞释放至外周血中的cfDNA与肿瘤负荷、肿瘤生长动力学和抗癌治疗相关。
现今常用的cfDNA检测技术为各类PCR，如数字PCR、突变体富集PCR和肽核酸锁核酸PCR等，二代测序技术更能高效且特异性的检测到肺癌患者血浆中的分子变化。然而，在循环中cfDNA处于高度片段化和低浓度状态，因此cfDNA的分离与富集面临挑战。
在临床上，cfDNA状态与NSCLC的诊断、微小残余病灶的监控、治疗应答的预测、预后和耐药性监控都具有相关性。在NSCLC病人中，cfDNA的浓度远高于健康人群，有研究表明高达4-8倍。在预测治疗应答中，cfDNA浓度的增加通常与化疗后肿瘤发展阶段相关，同时还可以通过检测cfDNA中肿瘤特异性的基因突变（如EGFR、B-Raf）来进行个性化治疗。在临床NSCLC预后中，铂化疗后如果cfDNA水平较高则OS期缩短，化疗后的肿瘤进展快、生存率差，某些时候cfDNA的检测比X光片更能反应出治疗效果。在NSCLC耐药性监控上，通过检测获得性耐药位点EGFRTM的突变状态，来监控是否对一线EGFR-TKI产生耐药，一旦产生耐药性，可以选择新一代EGFR-TKI，如AZD或Rociletinib进行治疗，同时还可以针对AZD的EGFRCS耐药位点进行耐药性监控。
?MicroRNAs
MicroRNAs是一类进化上保守的非编码小分子RNA，长度在19-22bp之间，在转录后负调控基因的表达，从而调控着细胞的生长、增殖、代谢和凋亡等。在包括肺癌在内的绝大多数恶性肿瘤中，miRs都能作为潜在的生物标记物。尤其是血浆miRs，具有稳定性好、组织特异性强或生物过程特异表达水平以及相对易于检测到等优点。
在临床上，miR的表达水平与NSCLC的诊断、治疗应答的预测和预后都具有相关性。对肺癌病人进行早期筛查，血浆中的miR无论在灵敏度和特异性上都要优于CT扫描，研究发现，miR-21、miR-,、miR-、miR--5p、miR--3p和miR-a等都在肺癌中有特异性表达。在NSCLC治疗应答的预测中，发现铂类化疗中miR-21表达水平与PFS呈负相关；而在晚期NSCLC使用培美曲塞的治疗中，发现miR-22表达水平的上升与产生耐药性相关。而在NSCLC预后监控中，研究发现检测血清miRs中的miR-，miR-30d，miR-1以及miR-等都能对非小细胞肺癌患者进行生存预测。
在过去十年中，在NSCLC患者的管理方面已经取得了巨大的进步，前景喜人。CTC和循环核酸作为用于肿瘤的早期诊断和监测潜在的强大工具，将有助于解决在日常临床上实施个性化癌症护理的问题。此外，CTC和循环核酸还可以提供关于肺癌的发病机制和肿瘤进展的过程的宝贵信息。
在肺癌的临床监护中，关于CTCs和cfDNA一直都有争议。CTCs技术的优点是能直接、可视观察肿瘤细胞；并能在转录水平分析CTCs的异质性，用来指导治疗方案和检测治疗效；还可进行异种移植。CTCs技术缺点是一切都是基于CTC表达上皮细胞特征，因而无法检测到上皮-间质的转化细胞；此外，CTCs主要为实体瘤突变，数量偏少。cfDNA的优势在于对血液类的肿瘤也能进行分析和检测；其次能反应肿瘤的突变量和瘤内异质性；最后相比而言更容易从血浆中分离抽提出来。因此cfDNA更倾向于基因分型分析，而CTCs则能提供DNA、RNA以及蛋白质层面的分析，指导患者的个性化治疗。miRs尽管作为肺癌液体活检标记物还在初步阶段，但是它与耐药性有比较紧密的关系。现将CTCs、循环DNA和MicroRNA各自优缺点总结如表一。
表一：循环生物标记物的优缺点比较
生物标记物
CTCs
cfDNA
miR
优点
CTCs数量检测可用于早期筛选、手术预后、疾病晚期监测
总cfDNA水平和突变状况能反应肿瘤量
痰和血液都能作为检测标本
分子畸变（点突变、重排）都能被检测
二代测序技术可检测与临床相关的分子变化
现有数据即可用于诊断、预后
单细胞水平分析肿瘤异质性
当缺少组织样本时，也可用于分子分类（如EGFR、ALK等）
高重复率以及成本相对低廉（基于RT-PCR技术）
可用于RNA和蛋白质分析
与CTCs相比过程更简单
可异种移植用于体外药物敏感性等类似实验
缺点
CTCs的检测和捕获实验一致性差，而且缺少一个统一标准
DNA的抽提和样本处理方法同样缺少一个统一标准。
对于MiR的用法、特征不同文献有不同报道
以上皮细胞抗体来富集CTCs的方法对上皮-间质转化的细胞无效，造成丢失
高度片段化
不能检测到特异性的分子事件
量少；有些个体难以检测
有些cfDNA来源于正常细胞，造成假阳性
与CTCs和cfDNA相比，数据偏少
成本昂贵
重排通常难以检测
不适用功能分析
综上所述，在过去的10年中，非小细胞肺癌的研究有着飞跃进展，CTCs和循环核酸为肺癌的发病机制研究和肿瘤进展监测提供了宝贵信息。用于早期筛查诊断和疾病监测的液体活检，是实施个性化癌症治疗的有力工具。虽然现在看似还不能进入常规的临床实践中，但通过前期实验和临床试验的整合，CTCs、cfDNA和microRNA作为非小细胞肺癌的循环生物标记物指日可待。
参考文献：MatikasA,SyrigosKN,AgelakiS.CirculatingBiomarkersinNon-Small-CellLungCancer:CurrentStatusandFutureChallenges.ClinLungCancer.Nov;17(6):-.
如需转载，请注明转自“上海生物芯片”，商业用途需经书面授权。
赞赏
